SHIV KU-1静脉途径感染恒河猴模型

一、 艾滋病概述

艾滋病(Acquired ImmunodeficiencySyndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病，是20世纪危害人类健康和生命最严重的病毒性疾病之一。自美国CDC报道首例艾滋病后，到20世纪80年代中期艾滋病发展成为一个性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690万人，2014年新增感染者200万，2014年因艾滋病死亡120万人。艾滋病在1985年传入我国，截至2015年5月31日，历年累计报告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成为关注的公共卫生和社会热点问题，艾滋病的预防与治疗也成为当代生物医学研究的前沿热点之一。

二、艾滋病动物模型简介

艾滋病发病机制研究、药物和疫苗的保护性研究及评价等方面在很大程度上依赖理想的动物模型。SIV/SAIDS(猴艾滋病)模型被广泛接受和应用，表现为和AIDS的临床表征，发病过程、免疫缺陷特征等非常相似。然而，由于HIV与SIV毕竟是两种不同的病毒，它们在基因序列、包膜结构和抗原性之间存在一定差异，使该模型的使用有一定的局限性。近年来，人们应用分子生物学技术，将HIV-1重要基因与SIV做成嵌合体病毒（SIV/HIV-1，简称为SHIV）感染恒河猴，用以研究HIV不同基因的功能以及病毒与宿主的相互作用。

SHIVKU-1是SHIV-HXBc2经恒河猴和猪尾猴系列传代得到的一株SHIV强毒株，它具有CXCR4嗜性，能在短期内引起感染猴外周血CD4+T细胞的耗竭，继而导致实验猴发病甚至死亡。

艾滋病的三种传播途径分别是经血液、性和母婴传播，性传播包括同性传播和异性传播两种方式。艾滋病动物模型的制备首先要考虑其实际应用价值，最好的动物模型可以最大限度的模拟人类疾病，包括使用与自然感染相同或接近的方式建立模型。为充分模拟静脉注射吸毒人群的感染方式，通过静脉途径，病毒直接感染血液中的靶细胞，从而制备静脉途径艾滋病恒河猴感染模型。

1、 实验用病毒：感染毒株为SHIV KU-1中国恒河猴细胞适应株，中国恒河猴PBMCs滴定TCID50滴度为103.75 TCID50/mL。

2、 感染动物：选用体重4-6kg的SPF恒河猴。实验前体检无异常，必须排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相关的4种基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）筛查结果为阴性。所有感染动物必须在ABSL-3室中进行。

3、 感染方法：用0.4ml SHIV KU-1病毒原液经后肢静脉接种恒河猴。

4、 SHIVKU-1静脉感染猴样品采集和指标测定：感染前和感染后按指定时间点采集EDTA抗凝血4mL，分别测定血常规、血浆病毒载量、CD4+/CD8+、CD4+细胞绝对数。

5、 SHIVKU-1静脉感染猴血浆病毒载量的测定：提取EDTA抗凝血浆中病毒RNA，使用SYBR Green I 实时荧光定量RT-PCR方法测定血浆病毒载量。

6、 SHIVKU-1静脉感染猴外周血CD4+/CD8+比值及绝对数测定：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE抗体标记EDTA抗凝全血淋巴细胞，流式细胞仪测定CD4+/CD8+比值，并根据血常规结果，计算出CD4+T细胞绝对数。

1、 临床症状

G1301V在长期感染过程中，健康状况良好，无典型感染症状。G1302V在感染前期状态良好，但自感染350d后精神逐渐萎靡，长期慢性腹泻，于感染后457d死亡。

2、 SHIVKU-1静脉感染恒河猴外周血病毒载量结果

两只实验猴（G1301V和G1302V）都在感染后第4d就检出了血浆病毒载量，其后一直在1.0×104 copies/mL左右波动，没有出现明显的载量高峰（图1）。

图1 SHIV KU-1静脉感染中国恒河猴外周血病毒载量结果

Fig.1 Theviremia (viral RNA copies/ml plasma) in Chinese-original rhesus macaquesinfected intravenously with SHIV KU-1

1、 SHIV KU-1静脉感染恒河猴CD4+/CD8+比值结果

感染后外周血中CD4+/CD8+都有一个明显下降过程（图2）。G1301V在感染后的3w内从感染前的1.96下降到0.50，短暂徘徊后持续上扬，至3个月，已基本恢复至初始水平，达到1.53；G1302V感染前1.21，感染后3w降至0.1，其后稳定在0.2左右，至感染后400d下降接近0。

图2 SHIV KU-1静脉感染中国恒河猴外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞比值

Fig.2 The changes of CD4+/CD8+ ratio of T lymphocytesin Chinese-original rhesus macaques infected intravenously with SHIV KU-1

SHIVKU-1静脉感染恒河猴CD4+细胞绝对数结果

两只猴G1301V和G1302V在CD4+T细胞绝对数上变化基本相同（图3）。感染后外周血CD4+T细胞数迅速下降，3w后分别从感染前990个/mL、1300个/mL下降到最低点420个/mL和76个/mL，其后基本保持水平，3个月时为590个/mL和180个/mL。G1302V在感染后期一直维持在100个/mL以下。

图3 SHIV KU-1静脉感染中国恒河猴外周血CD4+T淋巴细胞绝对数

Fig.3 The CD4+ T cell counts (per l blood) inChinese-original rhesus macaques infected intravenously with SHIV KU-1

1.该模型制备比较成熟，国内外都有此模型，构建和评价指标一致，所以该模型应用广泛，具有统一的操作规程。

2. 该模型制备的关键：1）小鼠必须是重度免疫缺陷的，而且饲养环境必须洁净；2）HIV操作需要生物安全。

3.此模型具有完善的人的免疫系统，HIV感染后，具有艾滋病病人相似的临床症状，所以具有很高的比较医学应用价值。